東北紅豆杉雜交種鑒定及遺傳多樣性分析

發(fā)布時間：2018/11/8

王丹丹1，張彥文1，2 ( 1. 遼東學院 農(nóng)學院，遼寧 丹東118003； 2. 東北師范大學 草地研究所， 吉林 長春 130024 ) [摘要] 本研究采用EST-SSR分子標記技術(shù)對東北紅豆杉雜交種進行快速鑒定和遺傳多樣性分析，建立東北紅豆杉雜交種快速鑒定體系，探究東北紅豆杉雜交種群體的遺傳信息，以期為保護東北紅豆杉種質(zhì)資源及其新品種選育提供科學依據(jù)。采用EST-SSR標記對126個東北紅豆杉雜交樣本及其親本基因組DNA進行擴增，分析雜交種與其父母本間擴增譜帶的多態(tài)性，以此鑒定雜交種的真?zhèn)?，并結(jié)合形態(tài)學特征對雜交后代的遺傳多樣性進行分析。結(jié)果顯示，從已開發(fā)的EST-SSR引物中篩選出12對多態(tài)性較高的引物，多態(tài)性比率為83.5%，平均PIC值為0.668，表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性；平均觀測雜合度（Ho）為0.440（0.257～0.587），平均期望雜合度為0.659（0.523～0.796），可見，期望雜合度比觀測雜合度要高；遺傳分化系數(shù)（FST）平均值為0.136（0.011～0.213），表明紅豆杉雜交種群體間遺傳分化程度適中，說明基因在雜交群體間流動較大，群體特征相對穩(wěn)定；采用2對紅豆杉多態(tài)性EST-SSR引物雜交種材料進行鑒定分析，*終從126份雜交后代樣本中鑒定出99個真雜交樣本?？梢姡珽ST-SSR分子標記用于紅豆杉雜交種鑒定及遺傳多樣性分析是可行的。 [關(guān)鍵詞] 東北紅豆杉；雜交種；EST-SSR標記；表型差異；遺傳多樣性 [中圖分類號] Q663.4 [學科代碼] 180.5155 [文獻標識碼] A 紅豆杉又名紫杉、赤松柏，常綠喬木，隸屬于紅豆杉科（Taxaceae）紅豆杉屬（Taxus）。紅豆杉起源于古老的第三紀，是第四世紀冰川后遺留下來的世界珍稀瀕危植物，在地球上已有250萬年的歷史，因此，又稱之為植物王國里的“活化石”。紅豆杉全世界共11種，自然分布*少，除澳洲的Austrotaxus Spicata產(chǎn)于南半球外，其余主要分布于北半球溫帶、寒溫帶、熱帶及亞熱帶高山地區(qū)，目前我國有4個種和1個變種，即云南紅豆杉、西藏紅豆杉、東北紅豆杉、中國紅豆杉和南方紅豆杉（變種）。紅豆杉的樹皮和樹葉中富含紫杉醇，對多種晚期癌癥療效突出，被稱為“治療癌癥的*后一道防線” [1]。 由于紅豆杉屬植物種群競爭力差，天然更新緩慢及地理分布*限等因素，導致紅豆杉屬植物資源儲備量日漸稀少，尤其近年來，隨著抗癌藥物紫杉醇的開發(fā)利用，對紅豆杉屬植物的需求日益增大，使其資源遭到了嚴重破壞，野生種群已瀕危，因此，世界各國將其列入保護樹種，被稱為“黃金樹”[2]。我國也于1999年8月4日批準頒發(fā)的“*重點保護野生植物名錄（*批）”中，將我國5種紅豆杉屬植物全部列入*一*保護植物。由于野生資源有限，而紫杉醇強大的市場需求量，加之各地對紅豆杉屬植物的推廣應用有限，所以急需培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、適應性強的紅豆杉品種，以達到資源的可持續(xù)利用[3-6]。 [收稿日期] [基金項目] 中央財政林業(yè)科技推廣示范資金項目（遼[2017]06號），遼東學院青年基金（2017QN050）。 [作者簡介] 王丹丹（1982—），女，講師，主要從事分子生物學的研究；E-mail:wangdandansq@sina.com。 通訊作者：張彥文，男，教授，主要從事繁殖生態(tài)學研究；E-mail:yanwen0209@163.com。 雜交（Hybrid）為具有差異的物種或具有相同基因型的個體進行有性交配的過程，是高等植物進化和新物種形成的主要方式之一[9]。雜交后的雜種F1代可能會在生長勢、生活力、抗逆性、產(chǎn)量、品質(zhì)等方面遠超其親本，即為雜種優(yōu)勢[10-13]。與傳統(tǒng)的選育引種相比紅豆杉屬植物的雜交育種更有利于綜合雙親的優(yōu)良性狀，并亦縮短培育周期。育種成敗的關(guān)鍵是理想親本的選擇，親本的優(yōu)勢特征和雙親的雜交配合程度在優(yōu)良品種的選育中起到?jīng)Q定性作用。由于紅豆杉屬植物為雌雄異株，風媒授粉，雜交過程中若隔離不嚴密，則容易出現(xiàn)雜交種生物性狀混雜現(xiàn)象，因此有必要對雜交后代進行鑒定分析[14]。對雜交后代的傳統(tǒng)鑒定方法為形態(tài)學鑒定，同一生境下，對不同種質(zhì)資源進行形態(tài)學鑒定可以快速分析其遺傳差異，但形態(tài)學鑒定*易受到環(huán)境和人為因素的影響，且田間測試周期較長，成本較高，而分子標記技術(shù)因其受環(huán)境飾變小、可重復性強、操作簡單、快捷等優(yōu)勢，已被廣泛應用在遺傳育種研究中。常用的分子標記SSR、SARP和RAPD等均被用于不同植物雜交后代的鑒定中，其中EST-SSR (Expressed Sequence Tag- Simple Sequence Repeats）分子標記為共顯性、擴增譜帶少、易識別、統(tǒng)計方便，結(jié)果可靠且重復性好、以及EST來自DNA編碼區(qū)，序列保守性相對較高，被認為是一種較為理想的鑒定雜交種的方法[15-17]。本試驗采用EST-SSR分子標記技術(shù)對東北紅豆杉雜交種進行快速鑒定和遺傳多樣性分析，建立東北紅豆杉雜交種快速鑒定體系，探究東北紅豆杉雜交種群體的遺傳信息，以期為保護東北紅豆杉種質(zhì)資源及其新品種選育提供科學依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 實驗材料 本試驗材料野生喬木型東北紅豆杉父本（Taxus cuspidata S. et Z.）和栽培灌木型日本紅豆杉母本，本文試驗材料日本紅豆杉又名矮紫衫（Taxus cuspidate var. nana Rehd），為東北紅豆杉的變種。2012年春在丹東市元寶區(qū)黑溝村三組一處溝叉栽培25株雌性日本紅豆杉，另配置2株野生雄性喬木型東北紅豆杉，園邊1公里內(nèi)無任何栽培和野生紅豆杉；在2013年獲得紅豆杉種子約5斤，然后對種子進行沙藏處理，于2014年秋季播種，2015年春季出苗，2017年選取126株雜交后代進行EST-SSR鑒定。 1.2 紅豆杉基因組DNA提取與純度檢測 采用CTAB法提取紅豆杉基因組DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度，模板用于分析時稀釋為40ng/μl，母液置于-20℃?zhèn)溆肹18-20]。 1.3 紅豆杉EST-SSR引物的開發(fā)與篩選 本研究從美國*生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Infoemation, NCBI）EST數(shù)據(jù)庫下載甜櫻桃的*EST序列，分別利用Blastclust、est_timmer、misa.pl和primer 3批量設(shè)計EST-SSR 引物[21-22]；用Blast對所開發(fā)的引物進行比對驗證，*后引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。試驗采用親本和雜交種的基因組DNA進行引物篩選，以能擴增出清晰、穩(wěn)定、可重復性條帶的引物作為下一步雜交種鑒定以及聚類分析的核心引物。 1.4 紅豆杉EST-SSR擴增 PCR擴增反應總體積為25 μl：dNTPs (2.5 mmol·L-1) 1μl，引物（10 μmol·L-1）各1μl，DNA 50 ng，Taq DNA聚合酶（2.5U·μl-1）0.2μl，Mgcl2 (1.5 mmol·L-1) 1.5μl，10×緩沖液 2.5μl，加ddH2O至25μl；PCR擴增程序為：95℃預變性15 min；95℃變性30 s，59℃或60℃退火90 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)；60℃延伸30 min。擴增產(chǎn)物用6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，170V電壓，70 min，銀染顯色。 1.5 紅豆杉F1代雜交種真實性鑒定 采用已篩選出的能在父母本間產(chǎn)生特異性條帶、且穩(wěn)定性及多態(tài)性較高的引物對雜交種進行真?zhèn)舞b定分析。若雜交種擴增譜帶中具有父本特異性條帶，即為真雜交種；若只有母本特異性條帶而無父本特異性條帶，即為自交種或偽雜交種。 1.6 紅豆杉雜交種群體EST-SSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性 根據(jù)擴增產(chǎn)物在電泳凝膠上的相對位置，對每對引物生成的不同帶型直接編號（按照分子質(zhì)量從小到大的順序記錄），擴增條帶在相同遷移位置上[23]，有帶記為1，無帶記為0，存入Microsoft excel中，采用POPGENE version 1.32軟件對每一個多態(tài)位點進行遺傳多樣性分析，包括擴增總條帶數(shù)N，多態(tài)性條帶數(shù)Np，多態(tài)性比率PPB，觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、遺傳分化系數(shù)(FST或GST)、基因流(Nm)（Nm=0.25（1－FST）/FST）等；利用公式： ，Pi和Pj分別為第i個和第j個等位基因頻率，n為等位基因數(shù)，計算生物多態(tài)信息含量PIC[24-28]。 2 結(jié)果與分析 2.1 DNA完整性檢測 采用CTAB法，均提取到高質(zhì)量東北紅豆杉基因組DNA；用紫外分光光度計檢測，其OD260/OD280比值均介于1.8～2.0之間，適于后續(xù)實驗；1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA的完整性如下(圖1)： 圖1 基因組DNA完整性電泳圖譜 Fig 1 Electrophoresis of genomic DNA integrity 2.2 紅豆杉F1代雜交種真實性鑒定 從已開發(fā)的引物中篩選出12對條帶清晰、帶型穩(wěn)定、多態(tài)性高的EST-SSR引物（表1），用于紅豆杉F1代雜交種真實性鑒定。共擴增出4種帶型，即“雜合型”、“父本型”、“母本型”和“其他型”，其中父本與母本均有特征帶，并且后代具有父本特征帶的即為真雜交種；若后代不具有父母本特征帶且與母本的電泳條帶有差異的子代，則可能為自交種或雜交種，有待進一步采用引物聯(lián)合法鑒定分析。采用能擴增出父本特征帶的引物Tc 6對126份紅豆杉雜交種進行鑒定，將能擴增出父本特征帶的單株評定為真雜交種。結(jié)果顯示（圖2），父本具有4條母本不具備的特征帶，通過對126份雜交種樣本的鑒定，其中8份雜交種樣本具有1條特征帶，27份雜交種樣本具有2條帶，41份雜交種樣本具有3條帶，1份雜交種樣本具有4條帶，而其余材料由于父本特征帶不明顯，暫不能評定為真雜交種，仍需進一步結(jié)合其他引物再次鑒定分析?？梢姡s交后代在任何1對引物擴增后具有父本1條或多條特征帶的均可評定為真雜交種。所以，由引物Tc 6初步鑒定，126份紅豆杉雜交后代中已有77份真雜交種。而后，將引物Tc 6擴增出無父本特征帶或特征帶不明顯的49份材料采用引物Tc 11進一步鑒定（圖3），將具有父本特征帶的22份后代評定為真雜交種。因此，評定雜交種的真實性需要采用多對引物結(jié)合鑒定，以便相互補充，以提高鑒定的真實性和雜交種的得率。 圖2 EST-SSR引物Tc 6對部分紅豆杉雜交種的篩選 FIG.2 The EST-SSR fingerprint amplified with primer Tc 9 in Taxus cuspidata hybrid 圖3 EST-SSR引物Tc 11對部分紅豆杉雜交種的篩選 FIG.2 The EST-SSR fingerprint amplified with primer Tc 11 in Taxus cuspidata hybrid 表1 EST-SSR分子標記引物序列 Table 1 Sequence of primer for EST-SSR molecular markers 引物 序列（5’ → 3’） 退火溫度(℃) 基序 片段大?。╞p） primer Sequence (5’ → 3’) Annealing (℃) Motif Size range TC 1 F：TACATGACAATGGCCTTCACAGC 59 (TA) 199～215 R：GTTTCTAAACAACAGCCCTCGAATGAGC TC 2 F：AGGGCTTGAGGTTGCTGGTACAC 59 (AC) 258～272 R：GTTTCTGACATAATCCACACCAAGGGAGC TC 3 F：TGAACGTGAACGAACTTGTCTCC 60 (TC) 324～328 R：GTTTCTCATGGGTTAGGCATGGACTTCAC TC 4 F：GCAAGCTGCACACTCCACAGTAG 60 (TA) 261～267 R：GTTTCTGGTGACACCCACGATTCTCAATAG TC 5 F：TTCGCATTTATAGATTCGGTCGG 59 (AG) 318～324 R：GTTTCTTCTCGATGTCTTCTACGCCTTGG TC 6 F：CTTGTTGCGAGAGAGAGGGAGTG 60 (GA) 243～249 R：GTTTCTAAACACAGCAGAGCCAAATGGTG TC 7 F：CTACGATGACACGCAAGAACACG 60 (AG) 104～116 R：GTTTCTTCTAAGTCTGCGTCCAGCTTTGG TC 8 F：TTCAGTGGTTTCATCTCTCATGACC 60 (CT)(CA) 150～158 R：GTTTCTTGCATCTCACCTTGTTAACTGTGC TC 9 F：CACAAGGATGAGTTTGGCCTCAG 59 (TCA) 265～310 R：GTTTCTTAGCGTGAACTGAAGGAGCTTGG TC 10 F：CCTTCGTACGTGCTTCCATCATC 60 (TCT)10 299～305 R：GTTTCTAACGCTTGGATCTAAATGAGGGC TC 11 F：CCTCGATTCTTAAACTGGAGTCGC 59 (TC)15 283～291 R：GTTTCTAATTCCATTCCTCCCAGCTCAAC TC 12 F： TTCTTATTCCTCTGTCCAGCGCC 59 (GA)9 134～138 R： GTTTCTAGCCATTCAAAGCGTTCCTTCTC 2.3 紅豆杉雜交種群體EST-SSR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性 本研究采用12對EST-SSR引物對99份紅豆杉雜交種基因組DNA進行多態(tài)性擴增，共擴增出85條帶，其中多態(tài)性條帶71條，多態(tài)性比率為83.5%。多態(tài)信息含量（PIC）是表示微衛(wèi)星DNA變異程度高低的一個指標，反映微衛(wèi)星DNA多態(tài)性高低，其取決于檢測的等位基因的數(shù)目和該基因的基因頻率分布，一般來說，PIC＞0.5，多態(tài)性較高；0.5≥PIC≥0.25多態(tài)性適中；PIC＜0.25，多態(tài)性較低。而本研究12對EST-SSR引物的平均PIC值為0.668（0.502～0.924，見表3），表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性；各個位點的平均觀測雜合度（Ho）為0.440（0.257～0.587），但平均期望雜合度為0.659（0.523～0.796），可見，期望雜合度比觀測雜合度要高。遺傳分化系數(shù)（FST）是衡量中群間的遺傳分化水平，0≤FST≤0.05，說明群體間遺傳分化水平較低；0.05＜FST≤0.15，說明群體間遺傳分化水平中等；0.15＜FST≤0.25，說明群體間遺傳分化水平較高，F(xiàn)ST＞0.25，表明群體間遺傳分化程度*高；而本研究FST平均值為0.136（0.011～0.213），表明紅豆雜交種群體間遺傳分化程度適中，說明基因在雜交群體間流動較大，群體特征相對穩(wěn)定。 表2 12對EST-SSR引物多樣性 Table 2 Genetic diversity of 12 pairs of EST-SSR primers 引物 觀測雜合度(Ho) 期望雜合度(He) 遺傳分化系數(shù)(FST) 生物多態(tài)信息含量(PIC) Primer bserved heterozygosity Expected hete-rozygosity heritability coefficient polymorphism information content Tc 1 0.556 0.632 0.141 0.715 Tc 2 0.481 0.658 0.072 0.502 Tc 3 0.324 0.796 0.158 0.924 Tc 4 0.528 0.688 0.152 0.704 Tc 5 0.257 0.571 0.092 0.657 Tc 6 0.436 0.677 0.207 0.569 Tc 7 0.411 0.523 0.213 0.721 Tc 8 0.332 0.712 0.051 0.578 Tc 9 0.534 0.657 0.202 0.801 Tc 10 0.339 0.591 0.121 0.620 Tc 11 0.587 0.613 0.011 0.539 Tc 12 0.499 0.789 0.208 0.691 平均值(Mean) 0.440 0.659 0.136 0.668 3 討論 本研究采用2對紅豆杉多態(tài)性EST-SSR引物對126份雜交種材料進行鑒定分析，*先利用1對引物Tc 6對雜交種進行鑒定，隨后采用引物Tc 11對將引物Tc 6不能評定為真雜交種的材料進行二次鑒定，*終從126份雜交后代中鑒定出99個真雜交種。在雜交種鑒定過程中共擴增出4種類型譜帶，即“雜合型”、“父本型”、“母本型”和“其他型”。“雜合型”為雜交種同時具備父母本的特征帶，該引物可以直接用于鑒定紅豆杉雜交種；“父本型”和“母本型”為雜交種的擴增條帶與父本或者母本的擴增條帶一致，大多是親本共同具有部分條帶，而父本或母本具有另外一些擴增條帶，雜交種亦相同，間接證明了“雜合型”的存在，其原因可能是由于親本的基因組DNA中具有多個能與引物結(jié)合的位點，因而親本擴增出多個擴增帶，雜交種的條帶也表現(xiàn)為“父本型”或“母本型”，該類引物可將雜交種和親本鑒定出來；“其他型”為雜交種可能比親本多了或少了一些條帶，可能是由于在雜交種配子體形成過程中，染色體減數(shù)分裂期，同源染色體發(fā)生配對與交換，或DNA復制過程中堿基突變等情況，同時驗證了雜交可使紅豆杉的雜交后代產(chǎn)生多種變異，使紅豆杉具有豐富的遺傳多樣性和表型多樣性。 雜種優(yōu)勢是生物界的一種普遍現(xiàn)象，是性狀表現(xiàn)不同的自交系雜交而產(chǎn)生的F1代，在一種或多種性狀上優(yōu)于雙親的現(xiàn)象。經(jīng)過多年的不斷深入研究，雜種優(yōu)勢已成為提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、改良品種和增強抗性等的重要手段。雜種優(yōu)勢在玉米、高粱、水稻和小麥上得到了廣泛的應用，而在紅豆杉屬植物上卻少有報道，尤其現(xiàn)在東北紅豆杉資源處于瀕危狀態(tài)，其中除人為因素破壞外，還包括東北紅豆杉自身的繁殖條件限制以及對生長環(huán)境要求高等因素，所以，有必要通過雜交育種的方式選育出優(yōu)勢品種，以達到對東北紅豆杉資源的保護及其資源更新，比如，本試驗中的雜交種生長勢較東北紅豆杉要強，冬季夜色濃綠，偏向木本日本紅豆杉，結(jié)果率較高等，而且雜交種的形態(tài)特征有分化，可根據(jù)其外形特點分別用于造林或景觀盆栽等。 通過本文試驗分析，EST-SSR分子標記用于紅豆杉雜交種鑒定是可行的，是一種準確、快捷的分子生物學手段，為紅豆杉雜種優(yōu)勢性狀的應用、性狀分離群體的鑒定分析以及種質(zhì)資源的遺傳改良提供科學依據(jù)。 [參 考 文 獻] [1] 張宗勤, 劉志明. 紅豆杉（第2版）[M]. 西北農(nóng)林科技大學出版社, 2014: 1–210. 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The results showed that 12 pairs of polymorphic markers were screened from the developed EST-SSR markers, which polymorphism rate was 83.5%, the mean value of PIC (Polymorphism information content) was 0.654, the mean value of Ho (observed heterozygosity) was 0.440, and the mean value of He (expected heterozygosity) was 0.659, so the He was larger than Ho, the average FST (genetic differentiation coefficient) was 0.136, which indicated that the genetic differentiation degree was moderate, the gene flow was large and its population acteristics were relatively stable among the hybrid populations； it had 99 true hybrids were identified from the 126 hybrid progenies with two polymorphic EST-SSR markers. So, it is feasible to use EST-SSR molecular markers to identify and analyze the genetic diversity of Taxus cuspidata hybrids. Key words: Taxus cuspidata； hybrid； EST-SSR molecular markers； phenotypic difference； genetic diversity